同型半胱氨酸短期干预对大鼠心房肌细胞钙超载的作用及机制研究  

Homocysteine induces calcium overload in neonatal rat atrial cells through activation of sodium current and CaMK Ⅱδ

作　　者：韩璐[1] 董泉彬 韦怡春 郑安财 李菊香[1] 洪葵[1] 吴延庆[1] 程晓曙[1] 

机构地区：[1]南昌大学第二附属医院心内科,330006

出　　处：《中华心血管病杂志》2018年第2期143-151,共9页Chinese Journal of Cardiology

基　　金：国家自然科学基金（81200132）;江西省自然科学基金（20152AcB20025）;江西省科技支撑项目（20151BB-G70166）

摘　　要：目的探讨同型半胱氨酸（Hcy）对乳鼠心房肌细胞（NRIC）钙超载的作用及其机制。 方法分离出生1~3 d的SD大鼠NRIC。NRIC接种后第3天分成以下几组：（1）对照组（不做任何处理）；（2）Hcy不同浓度组：NRIC中分别加入终浓度为50、100、200、500 μmol/L的Hcy培养48 h；（3）抗氧化剂（NAC）组：NRIC中加入10 μmol/L NAC培养24 h；（4）Hcy＋NAC组：NRIC中加入终浓度为500 μmol/L的Hcy培养48 h，然后加入10 μmol/L NAC培养24 h；（5）钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡδ）抑制剂（KN-93）组：NRIC加入3 μmol/L的KN-93孵育5 h；（6）特异性钠电流抑制剂（ELE）：NRIC中加入1 μmol/L的ELE孵育5 h；（7）Hcy＋KN-93组：NRIC加入终浓度为500 μmol/L的Hcy培养48 h，然后加入3 μmol/L的KN-93孵育5 h；（8）Hcy＋ELE组：NRIC中加入终浓度为500 μmol/L的Hcy培养48 h，后加入1 μmol/L的ELE孵育5 h；（9）Hcy＋KN-93＋ELE组：NRIC中加入终浓度为500 μmol/L的Hcy培养48 h，然后加入3 μmol/L的KN-93和1 μmol/L的ELE孵育5 h。慢病毒感染NRIC的分组及其干预：将NRIC以2×106个细胞/ml的密度接种于6孔板，培养48 h至细胞融合度达70%~80%。将包装的慢病毒载体原液加入完全培养基中，分别组成CaMKⅡδ-siRNA组和Nav1.5-siRNA组。阴性感染组仅加入含绿色荧光蛋白（GFP）的阴性慢病毒载体原液。3组MOI值均为10，感染24 h。在倒置荧光显微镜下观察感染后24 h各组细胞GFP荧光百分比，判断慢病毒感染效率，定期传代并进行Puro筛选，培养扩增稳转细胞，在构建成功的慢病毒干扰组的基础上加入Hcy处理，并分为Hcy＋CaMKⅡδ-siRNA组、Hcy＋Nav1.5-siRNA组和Hcy＋阴性感染组3组。采用Fluo-4/AM荧光探针检测NRIC内Ca2＋浓度（[Ca2＋]i）。采用以2＇，7＇-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）作为探针,用流式细胞仪检测NRIC内活性氧（ROS），硫代巴比妥酸比色法检测丙二�Objective To investigate the effect and related mechanism of homocysteine （Hcy） on calcium overload in neonatal rat atrial ceils （NRICs）. Methods NRICs were assigned to 9 groups after culture for 3 days： （1） control group; （2） Hcy group （0, 50, 100, 200, 500 μmol/L for 48 hours）; （3） antioxidant group （NAC, 10 μmol/L for 24 hours）; （4） Hcy±NAC group （500 p, mol/L Hcy for 48 hours, then treated with 10 μmol/L NAC for 24 hours）; （5） ealeium/ealmodulin dependent protein kinase 118 （CaMK 11 8） inhibitor group （KN-93, 3 μmol/L KN-93 for 5 hours）; （6） specific sodium current inhibitor group （ELE, 1 μmol/L ELE for 5 hours）; （7） Hey±KN-93 group （500 Ixmol/L Hey for 48 hours, then treated with 3 p, mol/L KN-93 for 5 hours）; （8） Hcy ±ELE group （500 μmol/L Hey for 48 hours, then treated with 1 μmol/L ELE for 5 hours; （9） Hcy±KN-93±ELE group （500 μmol/L Hey for 48 hours, then treated with 3 μmol/L KN-93 and 1 μmol/L ELE for 5 hours）. Moreover, NRICs were also treated with CaMK I1 8-siRNA lentivirus, and Nav1.5-siRNA lentivirus, negative lentivirus carrier containing green fluorescent protein （GFP） for 24 hours. The MOI values of the three groups were 10. Infection efficiency of lentivirus was determined by observing the percentage of GFP fluorescence under inverted fluorescence microscope after transfection for 24 hours, and cultured regularly with simultaneous Puro screening, then cells were grouped as Hcy±CaMK U 5-siRNA group, Hcy±Navl.5-siRNA group and Hcy±negative group. The concentration of Ca2. in NRICs （[Ca2±]） of various groups was detected through Fluo-4/AM fluorescence probe, then 2＇, 7＇- two chlorofluoreseein diacetate （DCFH-DA） was used as a probe to detect reactive oxygen species （ROS） in NRICs by flow cytometry. The malondialdehyde （MDA） was detected by the activity of superoxide dismutase （SOD） and xanthine oxidase was detected by thiobarbiturie acid colorimetry. The protein and mRNA e

关 键 词：心房 肌细胞 高半胱氨酸 钙超载 

分 类 号：R541.75[医药卫生—心血管疾病]