利用CRISPR/Cas9系统研究HIF-1α对巨噬细胞焦亡的影响  

作　　者：郭文 黄蓉 文丹 尤俊 卞娇娇 邓爱露 廖庆 夏天琴 胥正敏[1,2] 周春阳[1,2] 

机构地区：[1]川北医学院药学院,四川南充637000 [2]川北医学院药物研究所,四川南充637000 [3]川北医学院附属医院药剂科GCP,四川南充637000 [4]乐山市人民医院药剂科

出　　处：《中国老年学杂志》2024年第23期5817-5823,共7页Chinese Journal of Gerontology

基　　金：南充市科技项目(19SXHZ0443);川北医学院资助项目(CBY21-ZD05,CBY21-QA31)。

摘　　要：目的 探索乏氧诱导因子(HIF)-1α对巨噬细胞焦亡的调控作用,并初步探索其对动脉粥样硬化(AS)疾病的影响。方法 利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建靶向HIF-1α的单向导RNA(sgRNA)载体和Cas9载体双质粒病毒载体系统,T7核酸内切酶检测sgRNA在目的细胞内工作效率;通过慢病毒转染法将HIF-1α基因转染到巨噬细胞中,并分为阴性对照(Scramble)组、敲低(sgHIF-1α)组;Western印迹检测巨噬细胞内HIF-1α敲低效率。用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理细胞后,Western印迹检测焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-N、半胱氨酸天冬酶(Caspase)1和酶切(C)-Caspase1表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-1β的水平;实时荧光定量PCR检测IL-1α、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS),含NLR家族Pyrin域蛋白(NLRP)3的mRNA表达水平;光学显微镜观察细胞形态变化,电镜观察细胞焦亡情况;细胞膜红色荧光探针(Dil)和油红O染色检测巨噬细胞脂质吞噬功能变化。结果 测序结果显示成功构建CRISPR/Cas9双质粒系统;Western印迹结果显示成功构建HIF-1α敲低的巨噬细胞系;sgHIF-1α组显著增加巨噬细胞中GSDMD和Caspase1蛋白表达水平,而GSDMD-N、C-Caspase1蛋白、IL-1β水平、IL-1α、IL-1β、TNF-α、iNOS、NLRP3均明显低于Scramble组(P<0.05)。光学显微镜下可见Scramble组细胞膨大肿胀,细胞膜外周有气泡状突出物,而sgHIF-1α组细胞则未见明显肿胀和气泡状突出,扫描电镜结果显示Scramble组细胞膜形成较多大孔隙,而sgHIF-1α组细胞膜则未见大空隙;Dil和油红O染色结果显示敲低HIF-1α可降低巨噬细胞的脂滴吞噬功能。结论 CRISPR/Cas9双质粒系统能成功构建HIF-1α敲低的Ana-1巨噬细胞系;敲低HIF-1α能抑制巨噬细胞焦亡,并且抑制巨噬细胞的脂滴吞噬功能。

关 键 词：焦亡 乏氧诱导因子(HIF)-1α 利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9) 巨噬细胞 

分 类 号：R743.3[医药卫生—神经病学与精神病学]