Artificial metalloenzymes enabled by combining proteins with hemin via protein refolding  

蛋白重折叠策略整合蛋白骨架与氯化血红素用于构建人工金属酶

作　　者：Jingping Ouyang Zhenfang Zhang RenéHübner Henrik Karring Changzhu Wu 欧阳敬平;张振方;RenéHübner;Henrik Karring;吴昌柱(南丹麦大学物理、化学和药学系,欧登塞,丹麦;离子束物理和材料研究所,亥姆霍兹德累斯顿罗森多夫研究中心,德累斯顿,德国;南丹麦大学绿色技术系,欧登塞,丹麦;南丹麦大学丹麦高级研究所,欧登塞,丹麦)

机构地区：[1]Department of Physics,Chemistry and Pharmacy,University of Southern Denmark,Campusvej 55,5230 Odense,Denmark [2]Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf,Institute of Ion Beam Physics and Materials Research,Bautzner Landstrasse 400,01328 Dresden,Germany [3]Department of Green Technology,University of Southern Denmark,Campusvej 55,5230 Odense,Denmark [4]Danish Institute for Advanced Study(DIAS),University of Southern Denmark,Campusvej 55,5230 Odense,Denmark

出　　处：《Chinese Journal of Catalysis》2024年第12期157-165,共9页催化学报(英文)

摘　　要：In this study,we unveil a conceptual technology for fabricating artificial metalloenzymes(ArMs)by deeply integrating hemin into protein scaffolds via a protein refolding process,a method that transcends the conventional scope of surface-level modifications.Our approach involves denaturing proteins,such as benzaldehyde lyase,green fluorescent protein,and Candida antarctica lipase B,to expose extensive reactive amino acid residues,which are then intricately linked with hemin using orthogonal click reactions,followed by protein refolding.This process not only retains the proteins’structural integrity but expands proteins’functionality.The most notable outcome of this methodology is the hemin@BAL variant,which demonstrated a remarkable 83.7%conversion rate in cyclopropanation reactions,far surpassing the capabilities of traditional hemin-based catalysis in water.This success highlights the significant role of protein structure in the ArMs’activity and marks a substantial leap forward in chemical modification of proteins.Our findings suggest vast potentials of protein refolding approaches for ArMs across various catalytic applications,paving the way for future advancements in synthetic biology and synthetic chemistry.人工金属酶(ArMs)由起催化作用的金属催化剂和提供酶促反应微环境的蛋白骨架构成.人工金属酶的设计着重通过对现存蛋白骨架的理性设计将金属催化剂嵌入其中,并通过蛋白工程进一步提高催化性能.该方法受限于蛋白骨架的三维结构,无法将同一策略广泛地应用于不同的蛋白结构.同时,针对每个蛋白骨架的结构分析和精密设计限制了人工金属酶的功能范围拓展和催化效率提高.本文报道了一种泛用性的设计理念,通过蛋白重折叠过程将氯化血红素(hemin)深入整合至蛋白骨架中,打破了传统方法中主要针对蛋白与催化剂接触面的设计修饰,制得具有高活性的多功能ArMs复合物.首先,将苯甲醛裂合酶(BAL)溶于盐酸胍溶液中使蛋白质变性并暴露出所有可反应的活性位点.随后,通过巯基-烯点击反应将hemin与蛋白序列中的巯基连接,并通过重折叠过程将hemin包埋进蛋白的二级结构中,经过镍柱纯化得到ArMs复合物(hemin@BAL).热重分析结果表明,新的复合物结构中具有明显的hemin成分,并进一步通过电感耦合等离子体原子发射光谱确定了平均每个酶分子含有3.92个hemin分子,超出了常规化学修饰对于BAL表面巯基(2个)的修饰极限,表现出相较于传统方法的优越性.紫外-可见光谱结果表明,ArMs复合物中hemin的吸收峰迁移至410 nm,说明hemin的金属中心与纯化过程中加入的咪唑分子形成了稳定的螯合.同时,扫描透射电子显微镜和能量色散X射线谱结果表明,ArMs复合物呈现为聚集体形态并且表现出一致的碳元素和铁元素分布,再次证明了hemin与蛋白骨架的稳定结合.以氧化反应作为模式反应,ArMs在同等hemin含量下表现出3倍于游离hemin的转化率,并且在动力学分析中表现出远高于天然的辣根过氧化物酶的催化效率.此外,该ArMs还表现出等同于化学催化剂hemin的热稳定性,说明本文策略构建的ArMs具有

关 键 词：Artificial metalloenzyme Protein denaturation Click reaction Protein refolding HEMIN 

分 类 号：O62[理学—有机化学]