对旨在降低污水样本中的PCR检测抑制作用及提高病毒载量检测准确性的多种PCR优化技术的评价  

作　　者：石伟先(翻译) 

机构地区：[1]不详

出　　处：《中华实验和临床病毒学杂志》2025年第1期108-108,共1页Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology

摘　　要：分子分析既可定性也可定量,是检测污水中病毒的主要手段。然而,污水复杂的成分中包含多种分子检测的抑制物质,常导致假阴性结果、低估病毒的实际载量。新型冠状病毒感染疫情监测中,利用污水进行流行病学研究被广泛开展,开发可得到稳定结果且能有效降低污水中的抑制剂对检测结果的干扰的实验室检测技术至关重要。用于降低聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测抑制作用的方法有很多,其中最常见的是样本稀释和使用抑制剂去除试剂盒。本研究首先验证了污水样本中广泛存在PCR检测抑制物,而后评估了将样本10倍梯度稀释提取核酸,于PCR反应体系中添加不同剂量的T4基因32蛋白(gp32)、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、Tween-20、甘油6种试剂及使用抑制剂去除试剂盒共8种不同的实时荧光定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)优化策略。结果发现,其中样本10倍梯度稀释提取核酸、PCR反应体系中添加gp32、添加BSA以及使用抑制剂去除试剂盒四种方法可以消除假阴性结果,其中添加gp32(终浓度为0.2μg/μl)法降低抑制作用效果最为显著。将这一优化方案应用于检测10份污水样本中的新型冠状病毒载量,并与逆转录数字PCR(reverse transcription droplet digital PCR,RT-ddPCR)的检测结果进行了对比。结果显示,两种方法的检出率均为100%,但RT-ddPCR检测到的病毒浓度更高,优化后的RT-qPCR方案与RT-ddPCR之间呈现出良好的相关性(相关系数:0.713,P<0.007)。本研究是首个直接对比污水中常见降低PCR检测抑制策略的研究,发现了在PCR反应体系中加入gp32蛋白是既能降低抑制作用又能降低成本和分析时间的最佳方法,同时也证明了开发稳健检测方法和消除污水中PCR检测抑制剂的重要性。

关 键 词：假阴性结果 流行病学研究 聚合酶链式反应 冠状病毒感染 疫情监测 载量 抑制物质 试剂盒 

分 类 号：R73[医药卫生—肿瘤]