金葡菌TG-TPase嵌合基因在甲醇营养型酵母中的表达  

Expression of TP-TGase chimera derived from methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the methylotrophic yeast

作　　者：杨杰[1] 饶贤才[1] 侯瑞[1] 胡晓梅[1] 陈志瑾[1] 丛延广[1] 谭银铃[1] 朱军民[1] 周莹冰[1] 胡福泉[1] 

机构地区：[1]第三军医大学基础部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室

出　　处：《免疫学杂志》2009年第2期145-149,共5页Immunological Journal

基　　金：国家自然科学基金(30571666)资助

摘　　要：目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础。方法在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5α大肠埃希菌。经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用SalⅠ线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母。结果采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873bp的TGase片段和1044bp的TPase片段。以酶切连接构建的TG-TPase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1900bp的融合片段,与预期结果相符,测序表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA。结论成功构建了含TG-TPase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提。Objective To design a drug-resistance related TG-TPase chimeric gene derived from methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)and express the gene in Pichia pastoris.Methods The TGase domain of PBP2 and the TPase domain of PBP2a were amplified from MRSA DNA by PCR.The chimeric TG-TPase gene was constructed by processing standard genetic methods,and then cloned into the SnaB Ⅰ/Not Ⅰ sites of pPIC9K plasmid.After digestion by Sal Ⅰ,the linear pPIC9K-PBP2-2a was transformed into Pichia pastoris strain GS1...

关 键 词：MRSA TPase TGASE 毕赤酵母 

分 类 号：R346[医药卫生—基础医学]