TAGLN真核表达载体pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAG-LN-mut及稳定转染细胞株的构建  

Construction of a eukaryotic expression vector carrying tagln and establishment of a cell line stably expressing tagln

作　　者：方媛媛[1] 苏红[1] 周慧敏[1] 林 

机构地区：[1]中山大学孙逸仙纪念医院消化内科,广东省广州市510120 [2]中山大学孙逸仙纪念医院恶性肿瘤基因调控与靶向治疗广东普通高校重点实验室,广东省广州市510120

出　　处：《世界华人消化杂志》2012年第25期2397-2403,共7页World Chinese Journal of Digestology

基　　金：国家自然科学基金青年科学基金资助项目;No.30901782;中央高校基本科研业务费专项基金资助项目;No.11ykpy32~~

摘　　要：目的:构建携tagln基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的人结肠癌细胞株RKO并鉴定.方法:通过Gateway克隆技术,使用pOTB7-TAGLN-mut与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与pcDNA6.2/EmGFP-BsdV5-DEST空载体进行LR重组反应,生成目的质粒pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut通过测序验证目的质粒的插入序列.将携带tagln的真核表达载体和对照质粒稳定转染至人结肠癌细胞株RKO.通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测tagln的mRNA和蛋白表达水平.通过细胞侵袭实验了解transgelin在结肠癌细胞RKO中的作用.结果:携带tagln的真核表达载体测序分析显示插入序列及位点正确;实时荧光定量PCR及免疫印迹结果显示,稳定转染重组目的质粒的细胞株(RKO-TAGLN细胞)中tagln的表达水平与转染对照质粒的细胞株(RKO-CTRL细胞)及野生型RKO细胞相比明显上调,差异具有统计学意义(mRNA相对表达水平分别为45.58±12.79、1.32±0.43和1,P<0.01;蛋白质灰度定量值为1.69±0.04、0.29±0.05和0.29±0.04,P<0.01).细胞侵袭实验提示,RKO-TAGLN细胞较RKO-CTRL细胞的侵袭能力提高(161.76%±61.18%,P<0.01).结论:成功构建携tagln基因的真核表达载体并建立过表达transgelin的稳定细胞株和对照细胞株,为研究transgelin在结肠癌中的作用奠定基础.AIM： To construct a eukaryotic expression plas- mid carrying tagln （the gene encoding transge- lin） and establish the human colon carcinoma cell line RKO stably expressing tagln.RESULTS： Sequencing analysis showed that tagln was successfully inserted into the pcDNA6.2/ EmGFP-Bsd/V5-DEST plasmid. Real-time RT-PCR and Western blotting indicated that the expres- sion of tagln increased remarkably in RKO cells transfected with the pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5- TAGLN-mut plasmid （RKO-TAGLN cells） as com- pared to those transfected with the control vector （RKO-CTRL cells） and non-transfected RKO cells （relative mRNA expression levels ： 45.58 ± 12.79, 1.32 ± 0.43 vs 1, both P 〈 0.01; protein expression levels： 1.69 ± 0.04, 0.29 ± 0. 05 vs 0.29 ± 0.04, both P 〈 0.01）. Overexpression of tagln increased cell inva- sion by 161.76% ± 61.18% in RKO cells （P 〈 0.01）. CONCLUSION： A eukaryotic expression plasmid carrying tagln has been successfully generated and a RKO cell line stably expressing tagln has been established. These lay a foundation for further research of the role of transgelin in human colon carcinoma.

关 键 词：TRANSGELIN 结肠癌 人结肠癌细胞RKO Gateway克隆技术 

分 类 号：R735.35[医药卫生—肿瘤]