重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定  

作　　者：孙夏瑜[1,2] 李杰 武坚锐[1,2] 周岩[1,2] 郭跃贞[1,2] 

机构地区：[1]山西省儿童医院 [2]山西省妇幼保健院 [3]太原市急救中心,山西太原030013

出　　处：《中国优生与遗传杂志》2014年第7期18-20,共3页Chinese Journal of Birth Health & Heredity

摘　　要：目的克隆人凝血因子Ⅷ(Human Coagulation FactorⅧ,rhFⅧ)基因cDNA,利用bac-to-bac杆状病毒表达系统制备具有高凝血活性rhFⅧ。方法利用PT-PCR和overlap PCR技术扩增人FⅧ基因,亚克隆至转移载体pFastBac HTB,进一步转化至感受态细菌DH10Bac(含穿梭载体Bacmid)中,同源转座、氨苄青霉素及蓝白斑筛选阳性克隆质粒Bacmid/rhFⅧ;PCR法鉴定重组质粒后转染昆虫细胞Sf9;利用病毒感染High five细胞进行蛋白表达,通过SDS-PAGE、Western blot及凝血活性检测方法分析蛋白表达。结果完成了rBac-rhFⅧ重组杆状病毒的制备,实现了rhFⅧ在昆虫细胞中的重组表达,rhFⅧ相对分子质量为184 kDa左右,SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致,同时具有良好的促凝血作用。结论利用杆状病毒-昆虫表达系统成功制备了具有一定促凝血活性的rhFⅧ,为人凝血因子Ⅷ进一步的开发及应用奠定了基础。

关 键 词：rhFⅧ 血友病 杆状病毒 表达 

分 类 号：R554.11[医药卫生—血液循环系统疾病]